| 产品名称 | 产品编号 | 规格 |
|---|---|---|
| TSAPLus荧光双标三色染色试剂盒 （绿光iF488+红光iF555） | BKM-0182 | （PLus荧光双标三色）100T 50μL |
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
TSAPLus荧光双标三色染色试剂盒 （绿光iF488+红光iF555） | G1226-50T | 50T |
G1226-100T | 100T |
产品简介
产品简介
本产品TSAPLus荧光双标三色染色试剂盒（绿光iF488+红光iF555），适用于石蜡切片免疫荧光双重染色，尤其适用于相同来源一抗的双重荧光免疫标记，也可用于不同来源抗体的双重荧光免疫标记。主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA技术主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在HRP催化H2O2下形成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。还可以通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。
除了本试剂盒内的荧光染料组合之外，也可以根据用户的荧光成像系统光源配置选择其他合适的荧光染料进行搭配组合试剂盒，开展TSA荧光多标实验，请联系我司技术支持4006 027 178。
TSA系列荧光染色试剂盒相关荧光染料的荧光光谱数据如下：
荧光染料类型 | 激发波长/nm | 发射波长/nm |
DAPI | 359 | 457 |
iF440-Tyramide | 434 | 480 |
iF488-Tyramide | 491 | 516 |
iF546-Tyramide | 541 | 557 |
iF555-Tyramide | 557 | 570 |
iF594-Tyramide | 588 | 604 |
iF647-Tyramide | 656 | 670 |
iF700-Tyramide | 690 | 713 |
iF750-Tyramide | 757 | 779 |
储存与运输
试剂盒内各组分按各自所需条件保存，冰袋（wet ice）运输。12个月有效。
组成
Component Number | Component | G1226-50T | G1226-100T | Storage |
G1226-1 | iF488-Tyramide | 25 μL | 2×25 μL | -20℃ |
G1226-2 | iF555-Tyramide | 25 μL | 2×25 μL | -20℃ |
G1226-3 | Tyramide稀释液 | 100 mL | 2×100 mL | 2-8℃ |
G1226-4 | DAPI（即用型） | 10 mL | 20 mL | 2-8℃ |
G1226-5 | 组织自发荧光淬灭剂（苏丹黑） | 10 mL | 20 mL | 室温 |
G1226-6 | 抗荧光淬灭封片剂 | 5 mL | 10 mL | -20℃ |
说明书 | 1份 | |||
实验前准备：
1. 自备0.01 mol/L PBS缓冲液（pH7.0-7.4，推荐G4202或G0002），3% H2O2和0.3% H2O2；
2. 自备一抗及相应HRP标记二抗，抗原修复液（根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液）；
3. 根据用量，按照下表比例配制TSA染色工作液。
TSA染色工作液 | 试剂名称 | 体积 |
TSA-488染色工作液 | Tyramide稀释液 | 1 mL |
0.3% H2O2 | 10 μL | |
iF488-Tyramide | 2 μL | |
TSA-555染色工作液 | Tyramide稀释液 | 1 mL |
0.3% H2O2 | 10 μL | |
iF555-Tyramide | 2 μL |
注：荧光Tyramide融化后离心机短时离心，干净吸头吹吸混匀后取用。TSA染色工作液建议现配现用，需4℃避光保存，24h内有效。
操作步骤
以组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水：
1. 组织切片脱蜡至水；
2. 抗原修复：根据所使用的一抗及样本类型，采用合适方式对组织切片进行抗原修复；
3. PBS清洗3次，每次5 min，然后用免疫组化笔对组织画圈标记；
4. 灭活内源性过氧化物酶：向切片上滴加3% H2O2覆盖组织，室温避光孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色。PBS清洗3次，每次5 min；
5. 封闭：切片水分稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清封闭30 min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂；
6. 一抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将一抗稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的一抗覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5 min；
7. 对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5 min；
8. 向组织上滴加50-100μL TSA-488染色工作液确保完全覆盖组织，室温避光孵育10 min。PBS清洗3次，每次5 min；
9. 微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（加热的温度和时间建议：加热到95℃以上，维持15分钟。）此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。
10. 重复步骤6，进行第二个一抗的孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将需检测的第二个抗体（一抗）稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的抗体覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5 min；
11. 重复步骤7，进行对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5 min；
12. 向组织上滴加50-100μL TSA-555染色工作液确保完全覆盖组织，室温避光孵育10 min。PBS清洗3次，每次5 min；
13. 细胞核复染DAPI：切片稍甩干后在组织上滴加DAPI（即用型）染色液，避光室温孵育10 min。PBS清洗3次，每次5min；
14. 组织自发荧光淬灭（可选）：向组织上滴加组织自发荧光淬灭剂（苏丹黑），室温孵育5 min，流水冲洗3 min；
15. 封片及镜检：切片稍甩干后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并采集图像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。
注意事项
1. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。
2. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。
3. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（调整范围1:200 - 1:1000）。
4. 如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育高丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育低丰度目的蛋白对应的抗体。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
（产品包装升级中，以实物为准。）
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