产品信息

产品简介

本产品TSAPLus荧光5标6色染色试剂盒，适用于石蜡切片免疫荧光多重染色，尤其适用于相同来源一抗的多重荧光免疫标记，也可用于不同来源抗体的多重荧光免疫标记 。主要原理是基于酪胺信号放大（TSA， Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA技术主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在 HRP催化 H₂O₂下形成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。本试剂盒使用荧光染料 440/488/546/594/647对酪胺进行标记，得到的荧光酪胺荧光强，信号稳定，应用于多次重复免疫标记实现多重荧光染色。

除了本试剂盒内的荧光染料组合之外，也可以根据用户的荧光成像系统光源配置选择其他合适的荧光染料进行搭配组合试剂盒，开展TSA荧光多标实验，请联系我司技术支持4006 027 178。

TSA 系列荧光染色试剂盒相关荧光染料的荧光光谱数据如下：

储存与运输

试剂盒内各组分按各自所需条件保存，冰袋（wet ice）运输。12个月有效。

组成

实验前准备：

1. 自备抗原修复液（根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液，柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）（推荐G1201，G1202，G1209等），Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0）（推荐G1206，G1207），Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0）（推荐G1203，G1218）；

2. 自备PBS磷酸盐缓冲液（推荐  G4202 或G0002）；

3. 自备TBST缓冲液（推荐G0004）;

4. 自备3% H₂O₂和0.3%H₂O₂；

5. 自备各种封闭用血清（根据抗体类型选择合适的封闭血清，推荐牛血清白蛋白 BSA GC305010或GC305006，正常驴血清G1217，正常兔血清G1209，正常山羊血清G1208）；

6. 自备所需一抗；

7. 自备对应HRP标记二抗（推荐GB23204；GB23301；GB23302；GB23303；GB23404）；

8. 根据用量，按照下表比例配制 TSA 染色工作液。

注：荧光 Tyramide 融化后离心机短时离心，干净吸头吹吸混匀后取用。TSA 染色工作液建议现配现用，需 4℃避光保存，24 h 内有效。

操作步骤

以组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水：

1. 组织切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10 min-环保型脱蜡液II 10 min-环保型脱蜡液III 10 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ5 min-蒸馏水洗；

2. 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3. 组化笔画圈：轻轻甩掉组织上多余液体，使用组化笔沿组织外围轮廓画一个与组织间隔 2-3 mm 的小圈，便于下游封闭及抗体标记操作，在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

4. 灭活内源性过氧化物酶：向切片上滴加3% H₂O₂覆盖组织，室温避光孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色。之后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

5. 血清封闭：切片稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA，室温封闭30 min（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源用3% BSA封闭）

6. 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

7. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50 min；

8. 加iF440-TSA染色工作液：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加50-100 μL iF440-TSA染色工作液，避光室温孵育10 min。 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；（注：这步之后，所有实验过程避光处理。）

9. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8 min停火8 min转中低火7 min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

10. 血清封闭：切片稍甩干后滴加3% BSA，室温避光封闭30 min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3% BSA封闭）

11. 加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

12. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min；

13. 加iF488-TSA染色工作液：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加50-100 μL iF488-TSA染色工作液，避光室温孵育10 min。 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

14. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8 min停火8 min转中低火7 min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

15. 血清封闭：切片稍甩干后滴加3% BSA，室温避光封闭30 min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3% BSA封闭）

16. 加第三种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜；（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

17. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。孵育完后，玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

18. 加iF546-TSA染色工作液：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加50-100 μL iF546-TSA染色工作液，避光室温孵育10 min。 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

19. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8 min停火8 min转中低火7 min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

20. 血清封闭：切片稍甩干后滴加3% BSA，室温避光封闭30 min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3% BSA封闭）；

21. 加第四种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜；（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

22. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。孵育完后，玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

23. 加iF594-TSA染色工作液：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加50-100 μL iF594-TSA染色工作液，避光室温孵育10 min。 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

24. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8 min停火8 min转中低火7 min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

25. 血清封闭：切片稍甩干后滴加3% BSA，室温避光封闭30 min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3% BSA封闭）

26. 加第五种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜；（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

27. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。孵育完后，玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

28. 加iF647-TSA染色工作液：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加50-100 μL iF647-TSA染色工作液，避光室温孵育10 min。 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

29. 细胞核复染DAPI：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。孵育完后，玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；

30. 组织自发荧光淬灭（可选）：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min；

31. 封片：玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；

32. 镜检成像：切片置于扫描仪下采集图像。（DAPI紫外激发波长352-399 nm，发射波长417-477 nm，蓝色；440激发波长426-450 nm，发射波长467-499 nm，青色；488激发波长484-504 nm，发射波长517-537 nm，绿色；546激发波长524-544 nm，发射波长558-586 nm，红色；594激发波长576-596 nm，发射波长612-644 nm，橙色；647激发波长608-668 nm，发射波长672-712 nm，粉色。）切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。

注意事项

1. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5 -10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光 。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。

2. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。

3. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（调整范围1:200 - 1:1000）。

4. 如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育高丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育低丰度目的蛋白对应的抗体。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）