| 产品名称 | 产品编号 | 规格 |
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| Calcein AM（钙黄绿素AM） | BKM-0280 | 0.1 mL |
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
Calcein AM（钙黄绿素AM） | 0.1 mL |
产品简介
Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester)，中文名称钙黄绿素AM或钙黄绿素乙酰氧基甲酯，是在Calcein (钙黄绿素)的基础上引入了乙酰氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。Calcein AM本身是一种细胞可渗透性、非荧光和疏水的化合物，进入细胞后，被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein)，从而被滞留在细胞内，而Calcein（最大激发波长：494 nm；最大发射波长：517 nm）可发出强绿色荧光。与其它同类探针（如 BCECF AM和CFDA AM）相比，由于Calcein AM的细胞毒性非常低，几乎不会影响细胞功能如细胞增殖或淋巴细胞的趋化性等，而且对pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前染活细胞的最理想荧光探针之一。
由于死细胞缺乏酯酶，Calcein AM仅用于对活细胞的活力测试和短期标记。核酸红色荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。Calcein AM常常与碘化丙啶PI联合使用，对活细胞和死细胞同时进行双重荧光染色。由于Calcein和PI-DNA 都可被490 nm激发，可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。
Calcein AM可以应用于大多数的哺乳动物细胞。有研究显示Calcein AM可以用于某些植物细胞如拟南芥(Arabidopsis)的根边缘样细胞及某些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae。某些寄生虫如Leishmania由于细胞膜组分的原因，Calcein AM不能进入活细胞，但却可以进入凋亡早期的寄生虫细胞，从而与PI联用用于检测凋亡早期的寄生虫。由于真菌和细菌有细胞壁，会阻碍Calcein AM进入细胞，因此Calcein AM不适合用于真菌和细菌。
Calcein本身是一种金属络合指示剂，在生理pH条件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金属离子络合时，荧光信号会发生淬灭，因此Calcein AM也是一种可用于测定线粒体通透性转换孔的绿色荧光探针。
本产品Calcein AM纯度高，溶解在无水DMSO中，浓度为2 mM。Calcein AM的常用终浓度为0.1-5.0μM，为得到比较理想的结果，请根据细胞类型和实验实际情况对Calcein的最终浓度进行适当调整。
储存与运输
-20℃保存与运输，有效期12个月。
组成
Component | G1728-0.1ML |
Calcein AM（钙黄绿素AM） | 0.1 mL |
说明书 | 1份 |
Calcein AM（钙黄绿素AM）染色工作液配制：
用合适的缓冲液，如无血清培养液、HBSS (G4203)或PBS (G4202)稀释本产品，配制成浓度为0.1-5.0 µM的Calcein AM染色工作液。
注：Calcein AM的最终浓度建议根据细胞类型和实验实际情况进行适当调整。
操作步骤
1. 悬浮细胞的荧光显微镜检测或荧光酶标仪检测：
a) 细胞按实验设计进行一定处理后，计数。取适当细胞250×g室温离心5 min，弃上清，加入适当体积的Calcein AM染色工作液使细胞密度约为1×106 /ml。
b) 37ºC孵育细胞30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间不同。可以考虑以30 min作为初始孵育时间，根据具体的实验情况进行适当优化得到更加理想的检测效果。
c) 孵育结束后，250×g离心5 min，吸除上清液，缓慢加入37ºC预热的培养液重悬细胞。
d) 重复步骤c两次或以上以充分洗涤去除残留的染色液。
e) 更换新鲜的37ºC预热的培养液，37ºC再避光孵育30分钟，以保证细胞内酯酶充分水解Calcein AM以生成有绿色荧光的Calcein。
f) 250×g室温离心5 min，吸除大部分培养液，用剩余培养液将细胞重悬后涂片，在荧光显微镜下观察或荧光酶标仪检测。Calcein的最大激发光波长为494 nm，最大发射光波长为514 nm。如有需要，也可进一步进行其它荧光的复染，注意整个过程均需避光操作。
2. 贴壁细胞的荧光显微镜检测或荧光酶标仪检测：
a) 将细胞接种于培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。
b) 吸除培养液，用PBS清洗细胞1-2遍。
c) 加入适当体积的Calcein AM染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。一般96孔板每孔体积为100 μl，24孔板每孔体积为250 μl，12孔板每孔体积为500 μl，6孔板每孔体积为1 ml。
d) 37ºC避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。以30 min作为初始孵育时间，根据所用细胞对孵育时间进行适当优化以得到更加理想的染色效果。
e) 孵育结束后，更换成新鲜的37ºC预热的培养液，37ºC再避光孵育30 min，以保证细胞内酯酶充分水解Calcein AM以生成有绿色荧光的Calcein。
f) 吸除培养液，用PBS清洗2-3次，然后加入无血清细胞培养液后即可在荧光显微镜下观察或荧光酶标仪检测。Calcein的最大激发光波长为494 nm，最大发射光波长为514 nm。如有需要，也可进一步进行其它荧光的复染，注意整个过程均需避光操作。
3. 流式细胞仪检测：
a) 贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，悬浮细胞直接使用，计数，取适量细胞250×g室温离心5 min，弃上清，加入适当体积的Calcein AM染色工作液，使细胞为单细胞悬液，并且细胞密度为约1×106 /ml，每个样品体积为1 ml。注：需要准备好仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制Calcein AM染色工作液的缓冲液宜保持一致。
b) 37ºC避光孵育30 min。
c) 孵育完成后，250×g室温离心5 min收集细胞。每个样品加入1 ml缓冲液，轻轻重悬，250×g室温离心5 min收集细胞。注：本步骤可去除多余染料及可能引起荧光淬灭的试剂。
d) 用400 µl缓冲液重悬细胞。如有需要，也可进行进一步染色。注意整个过程均需避光操作。染色后，将样品置于冰上，可以在1小时内进行流式细胞仪检测和分析。
e) 注意使用仅含缓冲液的并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。Calcein的最大激发光波长为494 nm，最大发射光波长为514 nm。
注意事项
1. 荧光染料均存在淬灭问题，一定要尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2. Calcein AM对湿度非常敏感，在潮湿环境中容易分解，因此Calcein AM溶液每次取完后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水吸头。
3. 由于Calcein AM在PBS等水溶液中不稳定，染色工作液必须现配现用。
4. 培养液中的血清和酚红对Calcein AM的染色有一定的影响，建议在加入Calcein AM工作液前充分洗涤细胞。
5. Calcein AM标记的细胞，荧光均匀，是细胞追踪和普通细胞质染色的良好选择，然而，它不与任何物质结合，可能会在几个小时内被主动抽出细胞，钙黄绿素在活细胞内的保留取决于细胞类型和培养条件的固有特性。
6. Calcein AM染色后不能进行醛类固定，否则Calcein会在固定时丢失。此外，质膜的任何干扰（例如去垢剂或胰蛋白酶处理）都会导致染料从细胞中渗漏。
7. 如果Calcein AM很难进入细胞，可以使用表面活性剂，如Pluronic F127 。 也可以用1/10浓度的Calcein AM溶液代替培养基。
8. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
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