产品信息

产品简介

本产品Cas9 Nuclease(SpCas9)，即CRISPR-associated endonuclease Cas9，是由大肠杆菌重组表达的Streptococcus pyogenes来源的RNA引导的序列特异性双链DNA内切酶。Cas9 Nuclease发挥双链DNA内切酶活性必须依赖gRNA（也称sgRNA，single guide RNA）介导。Cas9 Nuclease含有两个切割活性位点，分别切割靶DNA的两条链从而产生靶DNA双链断裂，其切割位点位于目标序列内，离PAM（5‘-NGG-3‘）区3个碱基的位置。如果靶DNA双链断裂发生在细胞内，由于细胞自身的DNA修复系统会引起基因靶位点的插入、缺失或替换，从而导致基因的缺失突变。

用途：体外gRNA筛选、体外gRNA引导特定双链DNA剪切等。

来源：Streptococcus pyogenes来源核酸内切酶，大肠杆菌重组表达。

纯度及浓度：SDS-PAGE检测纯度≥95%，无RNase残留，无非gRNA依赖的DNase残留，1 μM。

失活或抑制：65℃条件下5 min完全失活。

酶储存缓冲液：10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50%(v/v) glycerol，pH 7.4。

Cas9 Reaction Buffer(10х)：500 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 100 mM MgCl₂, 1 mg/mL BSA, pH 7.9。

图1. Cas9 Nuclease酶活性测试效果图。反应体系：20 μL ddH₂O、3 μL Cas9 Reaction Buffer(10х)、3 μL 300 nM gRNA(Target sequence：5‘-ATATAAATCAGCATCCATGT-3’)、1 μL Cas9 Nuclease(分别为4、2、1、0.2 pmol)，25℃预孵育15 min（CT表示体系用1 μL Nuclease-free water代替Cas9 Nuclease），然后加入3 μL 30 nM的pET28a线性化质粒，37℃孵育15 min后终止反应，用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。由图中可以看到gRNA与Cas9结合后，引导后者至pET28a与gRNA互补的序列酶切产生4314 bp和1324 bp的片段。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，12个月有效。

组成

操作步骤

1. 准备好体外消化反应各种试剂（将Cas9 Nuclease、gRNA、底物DNA、Cas9 Reaction Buffer于冰浴上，gRNA稀释至300 nM，底物DNA稀释至30 nM）；

2. 配制反应体系（以30 μL体系为例）：

3. 涡旋混匀后室温离心数秒，使液体聚于管底，25℃预孵育10 min；注：反应体系中可以加入终浓度1U/μL的RNase Inhibitor，防止RNase污染（相应减少Nuclease-free water体积维持反应总体系不变）。

4. 再向体系中加入3 μL 30 nM的底物DNA（终体积30 μL），轻轻混匀后离心沉淀液体，37℃孵育15 min，反应时间可以根据实际情况适当延长30-120 min；

5. 反应结束后，每个样品中加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL，货号G1234）室温孵育10 min（或65℃热处理5-10 min）；

6. 反应体系可以直接用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如不立即电泳，可以将体系置于-20℃备用。

注意事项

1. 本产品使用需注意RNase-free、DNase-free相关操作，所用试剂耗材都应保证Nuclease-free。

2. 酶制品使用时应放在冰盒内或冰上，建议分装使用，使用完毕后应立即置于-20℃保存。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）