产品信息

产品简介

本产品Tth Argonaute (TtAgo)，是由大肠杆菌重组表达的Thermus thermophilus来源的DNA引导的序列特异性DNA内切酶。其活性发挥必须依赖一段短的（16-18 nucleotide）5’磷酸化的单链DNA（sgDNA）作为介导，切割区域不需要Cas9 Nuclease需要的PAM区域，但Tth Argonaute (TtAgo)只含有一个切割活性位点，只能断裂与sgDNA互补的第10与11位碱基之间的磷酸二酯键。可以高效切割单链DNA以及大部分双链DNA底物（在双链DNA上产生单链断裂），对单链RNA底物有中等切割活性，对双链RNA底物无切割活性。TtAgo在65-85℃温度范围内具有活性，常规反应温度为75-80℃，如果温度低于70℃活性会大幅度下降。在体外实验体系中，sgDNA的摩尔量应超过TtAgo的5倍，否则容易出现非特异性活性。

用途：体外单链DNA、双链DNA剪切等。

来源：Thermus thermophilus来源核酸内切酶，大肠杆菌重组表达。

纯度及浓度：SDS-PAGE检测纯度≥95%，无RNase残留，1 μM。

酶储存缓冲液：10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50%(v/v) glycerol, pH 7.4。

TtAgo Reaction Buffer(10х)：100 mM Tris-HCl, 2.5 M NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCl₂, pH 8.0。

图1. Tth Argonaute (TtAgo)切割单链DNA效果图。反应体系：4 μL ddH₂O、1 μL 10хReaction Buffer、2 μL 10 μM靶ssDNA（sequence：5’-CTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGG-3’）、2 μL 50 μM sgDNA(Target sequence：5’-TGTTGGAATTTAATCG-3’)、1 μL TtAgo(分别为2、1、0.6、0.3 pmol)，80℃孵育30 min进行反应，反应完毕后立即冰浴。然后进行20% TBE-PAGE实验(恒压110V电泳150 min)之后用EB室温染色15 min，即可观察结果。由图中可以看到sgDNA与TtAgo结合后，引导后者至靶ssDNA与sgDNA互补的序列酶切产生39 nt和20 nt的片段。

储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，12个月有效期。

组成

操作步骤

1. 准备好体外消化反应各种试剂[将Tth Argonaute (TtAgo)、ssDNA Guide Oligonucleotide、底物DNA、TtAgo Reaction Buffer(10х)于冰浴上]；

2. 配制反应体系（以20 μL体系为例，可以进行适当调整）：

注：ssDNA Guide Oligonucleotide必须5’磷酸化（推荐使用G3458 T4 Polynucleotide Kinase实现ssDNA磷酸化或直接合成磷酸化ssDNA），其最适长度为16-18 nt；

3. 涡旋混匀后室温离心数秒，使液体聚于管底，80℃孵育30-60 min；

4. 迅速将体系置于4℃以终止反应（TtAgo在65℃以下无活性）；也可每个体系中加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL，货号G1234）室温孵育10 min以终止反应；

5. 反应体系可以直接用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如不立即电泳，可以将体系置于-20℃备用。

注意事项

1. 酶制品使用时应放在冰盒内或冰上，建议分装使用，使用完毕后应立即置于-20℃保存。

2. 在体外实验体系中，sgDNA的摩尔量应超过TtAgo的5倍，否则容易出现非特异性活性。

3. TtAgo的活性受Mg²⁺、Mn²⁺影响很大，如果出现不切割或非特异性切割可以通过调整浓度解决。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品仅供科研用途，不用于临床诊断！

（产品包装升级中，以实物为准。）